玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR 检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢（Exserohilum turcicum）和玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌（登录号MAT1-1：GU997138和MAT1-2：GU997137）和小斑病菌（登录号MAT1-1：X68399和MAT1-2：X68398）交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp（大病斑菌）与490、136 bp（小病斑菌）的特异性目的条带。25 μL多重PCR扩增体系：2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃（大病斑菌）和55.0℃（小斑病菌）,35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。     

A Dominant Inhibitor Gene Inhibits the Expression of Ht2 against Exserohilum turcicum Race 2 in Corn Inbred Lines Related to B14

The purpose of this study was to elucidate the genetic cause for the lack of express ion of the gene Ht2 against Exserohilum turcicum race 2 on certain genetic backgrounds related to the inbred line B14. Two such inbreds (A635Rp and B59), susceptible to this pathogen were crossed onto the inbred Oh43—-Ht2Ht2. The following generations: F₁, F₂, F₃, F₄, backcrosses to both parents, selfings of the backcrosses, in addition to the parent lines, were evaluated for Ht2 expression in this study. Plants of each generation were inoculated with E. turcicum race 2 and evaluated for the expression of the chlorotic-lesion resistance determined by the gene Ht2. In spite of the reported dominance of Ht2 on some genetic backgrounds, the F₁ generations studied here did not show Ht2 resistant lesions. The data presented herein suggest that B₁₄ and related inbred lines carry a dominant gene(I) that inhibits the expression of the Ht2 gene. Chi-square analyses of the reactions of 108 progeny families studied supported this hypothesis.     

玉米大斑病菌Helminthosporium turcicum致病毒素产生的条件及其特性

本试验对玉米大斑菌致病毒素(Ht—毒素)的产毒条件和毒素的一些特性进行了初步研究。结果表明,玉米大斑菌在25℃黑暗条件下用液体静止培养20d所得的毒素作用最强,在固体培养基质中,以粉碎的玉米碎粒最有利于Ht—毒素的产生(每百克玉米粒可获得Ht—粗毒素1.65g),其次是高粱粒和大米粒。Ht—毒素对热稳定,经煮沸和加热浓缩不会降低其生物活性而且活性还有升高的趋势,但是这种毒素对光却极不稳定,尤其是日光照射后,活性丧失很快。在pH3.0—4.5的偏致性条件下,Ht—毒素可保持活性达20d 以上,而以后随pH 值的升高,活性迅速丧失。     

辽宁常用玉米品种对大斑病的抗性鉴定

2012~2013年,应用田间人工接种的方法对目前辽宁省玉米生产中应用的55份玉米品种进行抗大斑病[Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard et Suggs]鉴定与评价,筛选出对大斑病表现1级高抗(HR)的品种4份、3级抗病(R)的品种9份和5级中抗的品种16份。试验结果表明:辽宁省玉米生产上应用的玉米品种中,表现为中等抗病或感病品种占大多数,表现高抗的玉米品种较少。     

引起水稻颖壳褐斑病的两种蠕孢菌分离鉴定

Brown spots on rice glumes cause withered seeds and yield loss. The rice seeds with brown spot disease were collected from the field of China Agricultural University experimental station in Beijing. Exserohilum rostratum and Bipolaris zeicola were identified as the pathogens which cause brown spot disease based on morphological and molecular characteristics and their pathogenicity.     

中草药提取物对大斑病凸脐蠕孢菌的抑菌特性

[目的]从天然植物中寻找新型植物源农药防治玉米大斑病.[方法]通过室内抑菌试验研究核桃青皮、连翘、大黄、柴胡、黄芪和党参6种中草药水提物对大斑病凸脐蠕孢菌[Exserohilum turcicum(Pass.) Leonard et Suggs]的抑制作用.[结果]6种中草药提取物对该菌均具有明显的抑制作用,不同中药的抑菌作用存在一定差异,以核桃青皮的抑菌效果最佳,其次为连翘、大黄、柴胡、黄芪和党参,各药物抑制该菌的半数有效浓度分别为1.04、1.12、1.18、1.39、1.48和1.57 g/ml.[结论]核桃青皮、连翘和大黄水提取物对植物病原菌有良好的抑制效果,为新型天然杀菌剂的研制和开发提供了新途径.     

玉米种质资源对大斑病的抗性鉴定

“八五”期间在昆明、成都、丹东等地对我国2538份玉米种质资源进行了大斑病抗性鉴定的结果；高抗材料2份，抗病材料12份，中抗材料127份，感病2397份。     

玉米大斑病菌的RAPD分析Ⅰ.应用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA

用采自河北、辽宁、黑龙江、山东、吉林等５省的１４个玉米大斑病菌菌株为试材进行液体培养，然后采用ＣＴＡＢ法从菌丝中提取ＤＮＡ，通过７５２型紫外光栅分光光度计检测，最后将所提取的ＤＮＡ在热循仪ＰＥ－４８００上进行随机引物多态性扩增。结果发现，所提取的ＤＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值介于１．７３０－１．８４７之间，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到了较清晰的扩增图谱，从而证明了采用的ＣＴＡ法是提取玉米大斑病菌ＤＮＡ并用于分子生物学研究的一种行之有效的玉米。     

抗玉米大斑病单基因处于杂合状态时的效应

单基因Ht1、Ht2、Ht3、HtN处于不同水平抗性杂合状态时对大斑病抗性的基因效应不同。通过单基因Ht1、Ht2、Ht3、HtN与同一水平抗性自交系以及与不同水平抗性自交系组配,研究单基因处于杂合状态时在控制病斑数量、面积、病斑扩展速度、产孢量和潜伏期等方面的单基因、多基因的联合效应。结果表明,抗性单基因HtN处于F1代杂合状态时,控制病斑数和病斑面积的效应最强;单基因处于杂合状态时,湿培48 h病斑全部能产生分生孢子,且处于同一水平抗性杂合状态时,Ht1控制产孢量的效应最强;Ht1处于中水平、Ht3处于高水平和HtN处于低水平垂直抗性杂合状态下,控制病斑扩展效应最强;而Ht2处于高水平垂直抗性杂合状态下,控制病斑扩展效应最弱;抗性单基因处于杂合状态下,控制潜伏期多表现超亲现象,HtN控制病害潜伏期比其它单基因显著。     

玉米大斑病菌HT-毒素对玉米叶片木质素含量的影响

本试验采用玉米大斑病菌２号小种产生的粗毒素和标准毒素（５－羟甲基－２－呋喃甲醛）进行玉米幼苗滴心处理,测定玉米大斑病菌ＨＴ－毒素处理后玉米叶片中木质素含量的变化。结果表明：毒素处理后属于亲和组合的玉米自交系木质素含量都有一定程度的提高,且处理后４８ｈ表现更为明显;非亲和组合的玉米自交系木质素含量变化不大,不同组合中木质素含量变化差异的原因尚需进一步研究。